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技术指标

外观:黄色无定型冻干粉末;蛋白纯度: ≥90%; 比活性: ≥15 U/mg 酶粉;过氧化氢酶:≤0.03%; 肌酐酶: ≤0.01%; 肌酸酶: ≤0.01%; ATP 酶: ≤0.005%

酶学性质

来源:微生物;分类: EC 1.5.3.1;分子量: 45 kDa(SDS-PAGE);等电点: 5.3;Km值: 5.6×10-3 M(Sarcosine);抑制剂: SDS,Zn2+,Cd2+;最适pH: 8.0;最适温度:50℃;pH稳定性:7.0-9.5(25℃,16 h);热稳定性:50℃ 以下稳定(pH 7.5,30 min);稳定性:-25~-15℃ 静置保存 12 个月保持 90% 以上活性。

用途:用于酶法肌酐试剂的研发和大量配制。

活性测定方法:

肌氨酸氧化酶插图

反应生成的醌亚胺(Quinoneimine dye)可在 555 nm 检测。

酶活定义:单位酶活定义为在下述条件下,每分钟催化生成1μmol H2O2所需的酶量。

试剂准备

试剂I:0.2 M Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0。

试剂II:1.0 M 肌氨酸溶液(8.9 g 肌氨酸溶解到 100 mL UP 水中)。

试剂III:1 kU/mL POD。

试剂IV:50 mM 4-AA溶液(1.016 g 4-AA溶于100 mL UP水)。

试剂V:50 mM TOOS溶液(1.657 g TOOS溶于100 mL UP水)。

酶稀释液:20mM Tris-HCl,pH 8.0,2mMEDTA。

按如下配制反应混合物:试剂I:5 mL;试剂II:10 mL;试剂III:0.25 mL;试剂IV:1.5 mL;试剂V:1.5 mL;双蒸水:31.75 mL;共50 mL,可用于50次反应。

操作步骤

1. 向1 mL比色皿中加入1 mL反应混合物。

2. 37℃ 温浴 5 min。

3. 向反应混合物中加入 20μL 待测酶液,混匀。

4. 37℃ 反应,在 555 nm 检测样品1 min内的吸光度变化(ΔAs)

*用酶稀释液替代酶液,其它步骤相同,所得溶液吸光度为空白吸光度(ΔAb)ΔA=ΔAs-ΔAb

活力计算

肌氨酸氧化酶插图1

1.020:反应液总体积(mL);

0.020:酶液体积(mL);

t:反应时间(1min);

df:稀释倍数;

1/2:1摩尔过氧化氢生成1/2摩尔醌亚胺染料;

1.0:光路长度(cm);

C:酶浓度(mg/mL);

39.2:标准反应条件下,生色基团在 555 nm 处毫摩尔吸光系数(cm2/μmol)。