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技术指标

外观:白色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥6 U/mg 酶粉;过氧化氢酶:≤0.03%;肌酐酶:≤0.01%;肌氨酸氧化酶:≤0.01%;NADH 氧化酶:≤0.01%

酶学性质

来源:微生物;分类:EC 3.5.3.3;分子量:48 kDa(SDS-PAGE);等电点:4.6;Km值:1.7×10-2 M(Creatine);抑制剂:Ag+,Cu2+,Hg2+;最适:pH 7.5;最适温度:45-50℃;pH 稳定性4.5-10.0(25℃,16 h);热稳定性 50℃以下稳定 (pH 7.5,30 min);稳定性:-25~-15℃ 静置保存 12 个月保持90%以上活性;保护剂:EDTA 及糖类物质

用途:水解肌酸,用于酶法肌酐试剂的研发和大量配制。

尿素(Urea)和 DAB(ρ-dimethylaminobenzaldenhyde)反应形成的黄色染料的量可通过分光光度计在 435 nm 检测。

酶活定义:单位酶活定义为在下述条件下,每分钟催化反应生成 1 μmol 肌酸完全转化为肌氨酸所需的酶量。

试剂准备

试剂I:0.1 M肌酸溶液。

试剂II:将 2.0 g DAB溶解在100 mL 二甲亚砜中,并加入 15 mL 浓盐酸。

酶稀释液:50 mM PBS,pH 7.5, 样品用酶稀释液将酶稀释至 2.0-3.0 U/mL。

操作步骤

1. 取1 mL试剂I于5 mL EP管中,37℃预热5min。

2. 加入0.1 mL酶液,混匀。

3. 37℃ 水浴反应 10 min 后,加入 2.0 mL 试剂II终止反应,并在 25℃ 放置 20 min。

4. 使用紫外分光光度计,测定反应液在435nm处吸光度值。

5. 酶稀释液代替酶液作为空白对照。

活力计算

3.1:反应液总体积(mL);

0.1:酶液体积(mL);

10:反应时间(min);

1.0:光路长度(cm);

df:稀释倍数;

C:酶浓度(mg/mL);

0. 321:黄色染料在 435 nm 处毫摩尔吸光系数(cm2/μmol)。