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技术指标

外观:白色至淡黄色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥30 U/mg酶粉;NADH/NADPH氧化酶:≤0.01%;ATP酶:≤0.03%;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶:≤0.01%

酶学性质

来源:微生物;分类:EC 2.7.1.1;分子量:36 kDa(SDS-PAGE);等电点:5.64;Km值:3.2×10-4 M(D-glucose),8.3×10-5 M(ATP);抑制剂:SDS,Ag+,Fe3+,Hg2+,Cu2+;最适pH:8.0;最适温度:45℃;pH稳定性:6.5-9.0(25℃,16 h);热稳定性:37℃以下稳定(pH 8.0,30 min);稳定性:-25~-15℃静置保存12个月保持90%以上活性;保护剂:BSA。

用途:用于肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等试剂的研发和大量配制。

酶活定义:单位酶活定义为在下述反应条件下,每分钟生成1μmol NADH所需的酶量。

试剂准备

试剂I:50 mM Tris-HCl,含13.3 mMMgCl2,pH 8.0。

试剂II:用试剂I溶解葡萄糖至终浓度0.67 M。

试剂III:用试剂I溶解ATP至终浓度16.5mM。

试剂IV:用试剂I溶解NAD+至终浓度6.8mM。

试剂V:用试剂I溶解葡萄糖-6-磷酸脱氢酶至300 U/mL。

酶稀释液:用试剂I溶解BSA至终浓度0.1%。

样品:用酶稀释液将酶液稀释至0.1-0.3U/mL。

操作步骤

1. 在3 mL比色皿中加入2.3 mL试剂I,0.5mL试剂II,0.1 mL试剂III,0.1 mL试剂IV,0.01 mL试剂V,30℃预热5 min。

2. 加入0.1 mL待测样品,混匀。

3. 在340 nm处测定1分钟内吸光度的变化率ΔAs。

*用酶稀释液替代酶液,其它步骤相同,所得溶液吸光度为空白吸光度(ΔAb)ΔA=ΔAs-ΔAb