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技术指标

外观:白色无定型粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥150 U/mg酶粉;核苷酶:≤0.01%;腺苷脱氨酶:≤0.1%

酶学性质

来源:微生物;分类:EC 2.4.2.1;分子量:29 kDa(SDS-PAGE);等电点:5.3;Km值:1.4×10-4 M(Inosine),7.4×10-5 M(Pi);抑制剂:不受NaN3抑制;最适pH:7.0;最适温度:65℃;pH稳定性:5.5-10.0(25℃,16h);热稳定性60℃以下稳定(pH 8.5,30 min);稳定性:-25~-15℃静置保存12个月保持90%以上活性;保护剂:BSA.

用途: 用于5’-NT,ADA等试剂的研发和大量配制。

酶活定义

单位酶活定义为在下述条件下,每分钟生成1μmol次黄嘌呤所需的酶量。

试剂准备

试剂I:称取 0.0372 g EDTA·2Na 溶于 40mL0.1M pH 7.5 磷酸钾缓冲液,加入 0.07g 胆酸钠,1mL 4-AA(50mM),调节 pH 至7.5,加入 200U 黄嘌呤氧化酶,用 0.1M pH 7.5 磷酸钾缓冲液定容至 50mL。

试剂II:在 40mL 水中,加入 0.39g NaH2PO4,0.57 g K2HPO4,调节pH至7.7,加入0.161g 肌苷,9.5mL TOOS (50mM),0.5mLPOD(1kU/mL),调节pH至7.7,用水定容至50mL。

酶稀释液:在 50mL 0.1M 磷酸钾缓冲液(pH7.5)中,加入0.0372g EDTA·2Na,0.07g胆酸钠。

样品:用酶稀释液将酶稀释至0.2-0.3 U/mL。

操作步骤

1.向1 mL比色皿中加入0.75 mL 试剂I,0.15mL 试剂 II,37℃ 预热 5 min。

2.加入0.015 mL 待测酶液,混匀。

3.37℃ 反应,用分光光度计在555 nm检测样品1 min内的吸光度变化(ΔAs)

*用酶稀释液替代酶液,其它步骤相同,所得溶液吸光度为空白吸光度(ΔAb)ΔA=ΔAs-ΔAb