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技术指标

外观:黄色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥200 U/mg 酶粉;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶:≤0.01%;NAD(P)H 氧化酶:≤0.01%.

酶学性质

来源:微生物;分类:EC 1.6.5.2;分子量:28 kDa(SDS-PAGE);等电点:5.2;Km 值:7.4×10-4 M(NADH),6.0×10-2 M(NADPH);抑制剂:Fe3+,Mn2+,Cu2+;最适pH:7.5;最适温度:45℃;pH稳定性:4.5-9.0(25℃,16 h);热稳定性50℃ 以下稳定(pH 7.5,30 min);稳定性:-25~-15℃ 静置保存12 个月保持 90% 以上活性;稳定剂:FMN,NAD(P)H。

用途:用于 β- 羟丁酸试剂的研发和大量配制。

酶活定义

单位酶活定义为在下述反应条件下,每分钟消耗1μmol DCPIP所需的酶量。

试剂准备

试剂I:200mM pH 7.0 Tris-HCl缓冲液。

试剂II:36 mM NADH溶液(用水溶解,现配现用,置于冰上)。

试剂III:2.4 mM DCPIP(用水溶解,室温放置,现配现用)。

试剂IV:200 mM Tris-HCl,pH 7.5,含0.5%Tween20。

待测样品:用试剂IV将酶液稀释至0.1-0.25U/mL。

操作步骤

1.在3 mL比色皿中加入2.4 mL水,0.3 mL试剂I,0.1 mL试剂II,37℃预热4 min。

2.加入0.1 mL待测样品,0.1 mL DCPIP,迅速混匀。

3.在600 nm处,1分钟内吸光度的变化率ΔAs。

*用酶稀释液替代酶液,其它步骤相同,所得溶液吸光度为空白吸光度(ΔAb)ΔA=ΔAs-ΔAb